Morfološka i molekularna karakterizacija sorte masline 'Krvavica' s
područja skradinskog zaleđa
Snježana Bolarić1 , Aleš Vokurka 1, Gordana Kožarić Silov 2 , Zorica Kauf 1 , Kristina Batelja
Lodeta 1, Đani Benčić1
1 Sveučilište u Zagrebu Agronomski fakultet, Svetošimunska cesta 25, Zagreb, Hrvatska
(avokurka@agr.hr)
2 Ministarstvo poljoprivrede, Uprava za stručnu podršku razvoju poljoprivrede i ribarstva,
Velimira Škorpika 13b, Šibenik, Hrvatska
Sažetak
Cilj istraživanja je morfološki opisati i utvrditi genetski profil skradinske sorte masline
'Krvavica' te usporediti njen SSR profil s SSR profilima sorata u javno dostupnim bazama u
svrhu potvrđivanja njenog jedinstvenog genotipa. Na temelju morfoloških svojstva stabla,
lista, cvata, cvijeta, ploda i koštice dan je opis sorte 'Krvavica'. Pomoću 11 dogovornih SSR
markera utvrđen je genetski profil 'Krvavice' i njegovom usporedbom s do sada opisanim
sortama maslina utvrđeno je sorta 'Krvavica' s područja Skradinskog zaleđa ima jedinstven
genetski profil.
Ključne riječi: Olea europaea L., fenotip, DNA identifikacija, SSR markeri
Uvod
Od početka domestikacije, maslina je vegetativno razmnožavana s ciljem iskorištenja
najboljih kombinacija gena koje su proizašle iz slobodne oplodnje i mutacija. Kao rezultat
toga danas je prisutan velik broj sorata (Carriero i sur., 2002.), čiji broj se procjenjuje na oko
1200, s oko 3000 sinonima. Evaluacija i opis sorata masline je presudna, a sama
identifikacija sorata je komplicirana uslijed postojanja velikog broja sinonima i homonima,
intenzivne razmjene biljnog materijala, prisutnosti unutarsortne varijabilnosti kao i problema
certificiranja materijala u rasadnicima (Taamalli i sur. 2006.). Skradinsko zaleđe ima
tradiciju uzgoja maslina i proizvodnja maslinovog ulja, a to područje je ujedno i krajnji rub
mediteranske regije, gdje se masline uzgajaju na dubokim tlima. Na tom je području u
proizvodnji maslinovog ulja u velikom udjelu zastupljena sorta masline 'Krvavica'. Zbog
velikog zanimanja struke i proizvođača za intenzivnim uzgojem 'Krvavice' javlja se potreba
za njenom revitalizacijom, a time i potreba za pouzdanim opisom sorte koji bi omogućio
pouzdanu identifikaciju na morfološkoj i molekularnoj DNA razini. Klasični pristup u
opisivanju i identifikaciji sorata zasnivao se na opisu njezinih morfoloških svojstava čija
ekspresija, iako genetski uvjetovana, može biti pod većim ili manjim utjecajem okolinskih
faktora. Prve opise maslina na temelju morfoloških svojstava dali su Bulić, (1921.), Marčić
(1923.) i Hugues (prijevod i reprint, 1999.), a u novije vrijeme Bakarić (2002., 2005a.,
2005b., 2007.). Međutim, sigurnoj identifikaciji sorata maslina uvelike je pridonijela
primjena DNA analiza, u prvom redu SSR molekularnih markera (mikrosatelita) koji DNA
profiliranjem nadopunjuju morfološke opise i na taj način nadilaze dvojbene slučajeve
identifikacije sorata uzrokovane djelovanjem okolinskih faktora na ekspresiju morfoloških
svojstava. Mikrosatelitske regije su vrlo rašireni segmenti zastupljeni unutar čitavog
genoma, kodominantne su prirode, vrlo su polimorfni i informativni, a analize su ponovljive
i usporedive između različitih laboratorija (Rafalski, 1996., Kumar i sur., 2009.), za što je
ipak potrebna vještina i tehnička obuka. Prvu genotipizaciju sorata maslina na području
Hrvatske su primjenom SSR markera proveli Štambuk i sur. (2007.). U genotipizaciju su
03 | Genetika, oplemenjivanje bilja i sjemenarstvo
340 56. hrvatski i 16. međunarodni simpozij agronoma | 5. do 10. rujna 2021., Vodice, Hrvatska
bile uključene sorte masline s dubrovačkog područja, među kojima je bila i sorta 'Krvavica'
s otoka Šipana. Rezultati tih istraživanja potvrdili su pretpostavku da je 'Krvavica' istovjetna
sorti 'Murgulja', tj. da je njen sinonim. S obzirom da se na dubrovačkom području sorta
'Krvavica' (sin. 'Murgulja') uzgaja kao stolna sorta, za razliku od skradinske 'Krvavice' koja
je isključivo uljna sorta, Crnica (2011.) je primjenom SSR markera, utvrdila da skradinska
sorta 'Krvavica' nije istovjetna 'Murgulji', a isto tako niti 'Krvavici' s dubrovačkog područja
gdje se uzgaja za proizvodnju ulja. Također je prilikom genotipizacije hrvatskih sorata
masline SSR markerima utvrđeno da skradinska 'Krvavica', nije istovjetna niti jednoj drugoj
hrvatskoj sorti (podaci još nisu objavljeni).
Cilj istraživanja je dati morfološki opis i genetski (SSR) profil skradinske sorte masline 'Krvavica'
te usporediti njen SSR profil s SSR profilima sorata masline u javno dostupnim bazama Olea
Database (
http://www.oleadb.it/) i Worldwide Olive Germplasm Bank of Córdoba-WOBGC
(Trujillo i sur., 2013.) u svrhu potvrđivanje njenog jedinstvenog genotipa.
Materijal i metode
Proučavana stabla masline 'Krvavica' nalaze se na području Skradina na lokacijama Ićevo i
Drače (udaljeno oko 800 m od lokacije Ićevo). Opažanje morfoloških svojstava obavljeno
je na tri stabla starija od 150 godina i na tri stabla u masliniku novijeg datuma. Budući da se
morfološki opis 'Krvavice' vršio u zatečenim nasadima, bez prisutnosti referentnih sorata za
procjenu ekspresije pojedinog svojstava, preferirano je njihovo izravno mjerenje. Za
nemjerljiva svojstva, morfološki opis je izveden uz pomoć ocjena (Kauf, 2008.). Mjerenje
svojstava rodnih izboja, listova i cvatova provedeno je na uzorcima od po 25 tipičnih biljnih
organa po stablu, dok su svojstva ploda i koštice mjerena na uzorku od po 50 plodova i
koštica po stablu. Uzorci izboja, cvatova i plodova nasumično su uzeti sa cijelog stabla.
Za SSR analizu uzeti su uzorci mladih listova 'Krvavice'. Uzorci listova osušeni su u
liofilizatoru (Christ Beta 1-8) i samljeveni u fini prah pomoću oscilatornog mlina (T Verter,
N2-series). Izolacija DNA molekula iz lista izvedena je kitom DNeasy Plant Mini Kit
(Qiagene). Količina izolirane DNA utvrđena je pomoću fluorimetra VersaFluor ver. 170-
2402EDU (Biorad) i razrjeđena je na radnu koncentraciju 5 ng μl -1 . Za SSR analizu korišteno
je 11 dogovornih SSR početnica specifičnih za maslinu (Baldoni i sur., 2009.) obojenih s
fluorescentnim bojama (Dye) (Tablica 1).
Tablica 1. SSR početnice korištene u molekularnoj karakterizaciji sorte masline 'Krvavica'
Naziv početnice Dye Naziv početnice Dye Naziv početnice Dye
ssrOeUA-DCA3 6Fam ssrOeUA-DCA16 6Fam GAPU-101 6Fam
ssrOeUA-DCA5 Ned ssrOeUA-DCA18 Ned GAPU-103A Vic
ssrOeUA-DCA9 Vic UDO099-043 Vic EMO90 Vic
ssrOeUA-DCA14 Ned GAPU-71B 6Fam
PCR reakcija volumena 10 μl sadržavala je 1x PCR reakcijski (10 mM Tris-HCl pH 8,3; 50
mM KCl; 1,5 mM MgCl2 (Sigma-Aldrich, SAD), 0,2 mM svakog nukleotida (dATP, dCTP,
dGTP i dTTP; Sigma-Aldrich), po 0,8 μM F i R početnice (Applied Biosystems, SAD u
daljnjem tekstu AB), Taq polimerazu (Sigma-Aldrich) i genomsku DNA. DNA fragmenti
su amplificirani prema touch-down protokolu (Thiel i sur., 2003.) u thermal cycleru Veriti™
96-Well (AB) u sljedećim temperaturnim uvjetima: početni korak denaturacije na 95 °C 5
min; osam touch-down ciklusa [30 sek na 95 °C, 30 sek na 62 °C (temperature nalijeganja
početnice je sa svakim ciklusom smanjena za po 1 °C), i 30 sek na 72 °C], zatim 28 ciklusa
pri temperaturnim uvjetima 30 sek na 95 °C, 30 sek na 55 °C, i 30 sek na 72 °C; i na krajuDownloaded from
https://cabidigitallibrary.org by 109.245.58.169, on 10/24/24.Subject to the CABI Digital Library Terms & Conditions, available at
https://cabidigitallibrary.org/terms-and-conditions03 | Genetics, Plant Breeding and Seed Production
56th Croatian & 16th International Symposium on Agriculture | September 5 - 10, 2021, Vodice, Croatia 341
završni korak elongacije 5 min na 72 °C. Amplificirani fragmenti DNA razdvojeni su u
kapilarnoj elektroforezi (Genetic Analizer 3130, AB), a njihova veličina utvrđena je pomoću
GeneScan™ 500 LIZ™ dye size standarda (AB). Duljine fragmenata su harmonizirane, tj.
uzet je u obzir “pomak” (razlika) od jednog ili više nukleotida za isti alel prisutan na istoj
sorti u više baza podataka. Ovo je učinjeno na temelju referentnih sorata čija autentičnost
nije upitna i koje su prisutne istovremeno u našem istraživanju i u navedenim bazama.
Rezultati i rasprava
Stabla ‘Krvavice’ i njihovi pojedini organi (izboji, list, plod, itd.) opisani su prema UPOV
deskriptoru (UPOV, 1985.) (Tablica 2). Iako je riječ o morfološkim svojstvima koja su za
sortu više ili manje konstantna tj. genetski uvjetovana i pod manjim utjecajem okoline, na
ekspresiju pojedinih od tih svojstava ipak ima utjecaj okolina, poput bujnosti krošnje.
Stabla 'Krvavice' uključena u analizu su vrlo bujna što, slijedom rečenoga, može biti rezultat
dubine tla na lokaciji na kojoj je izvršena ocjena. Grane su uspravnog (erektilnog) rasta i
tvore gustu krošnju. Duljina internodija rodnih izboja je u prosjeku 14,59 mm, a njihova boja
je sivo zelena. Duljina lista je prosječno 52,60 mm, a širina 13,44 mm, pri čemu prosječni
omjer duljine i širine, kao vrlo konzervativni morfološki element, iznosi 3,94. Oblik lista je
eliptično-kopljast i nema sjaja, uzduž osi plojke je ravan do konveksan, a zakrenutost (u
obliku spirale) nije uočena. Parametri boje prema RHS referentnim vrijednostima su 139A
za lice i 193A za naličje. Cvat se sastoji od prosječno 10,5 cvjetova, sa značajnim udjelom
razgranjenosti iz baze, pa indeks razgranjenosti kod 'Krvavice' iznosi 1,3. Duljina cvatne osi
je u prosjeku 2,43 cm, a pazušni cvjetovi nisu učestali. Duljina cvjetnog pupa neposredno
prije otvaranja je 2,39 mm, a njegova širina 3,72 mm. Boja ploda je tamno ljubičasta, duljina
je u prosjeku 20,73 mm, a širina 16,04 mm i indeks omjera duljine i širine iznosi 1,29.
Prosječna masa deset plodova je 30,71 g. Prosječna duljina koštice je 14,8 mm, širina 8,21
mm, a indeks omjera duljine i širine koštice je 1,81, što je morfološko svojstvo pod
minimalnim utjecajem okoline.
Tablica 2. Morfološka svojstva skradinske sorte masline 'Krvavica'
Svojstvo Opis Svojstvo Opis
stablo
bujnost velika broj grana avg = 1,30
položaj grana uspravan cvat broj cvjetova avg = 10,50
gustoća krošnje gusta duljina cvatne osi (cm) avg = 2,43
rodni duljina internodija (mm) avg = 14,59 pazušni cvjetovi rijetka pojava
izboj boja sivo zelena cvijet duljina pupa (mm) avg =2,39
list
duljina (mm) avg = 52,60 širina pupa (mm) avg = 3,72
širina (mm) avg = 13,44
plod boja ploda tamno
ljubičasta
omjer d/š avg = 3,94 d - duljina (mm) avg = 20,73
sjaj bez sjaja š - širina (mm) avg = 16,04
boja lica (RHS*) 139A omjer d/š avg = 1,29
oblik
eliptično-
kopljast
masa 10 plodova (g) avg = 30,71
boja naličja lica (RHS*) 193A koštica d - duljina (mm) avg = 14,80
zakrenutost (twisting) odsutna š - širina (mm) avg = 8,21
zakrivljenost osi plojke
ravan do
konveksan
omjer d/š avg = 1,81
* RHS colour chart – the standard reference for plant colour identification. Royal Horticultural Society.
Na Agronomskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu (UniZg) pomoću dogovornih SSR
markera (Baldoni i sur., 2009.) izrađen je genetski profil skradinske sorte 'Krvavica' (Tablica
3) čiji su aleli nakon harmonizacije usporedivi s veličinama alela u javno dostupnim bazamaDownloaded from
https://cabidigitallibrary.org by 109.245.58.169, on 10/24/24.Subject to the CABI Digital Library Terms & Conditions, available at
https://cabidigitallibrary.org/terms-and-conditions03 | Genetika, oplemenjivanje bilja i sjemenarstvo
342 56. hrvatski i 16. međunarodni simpozij agronoma | 5. do 10. rujna 2021., Vodice, Hrvatska
pa su kao takvi i usporedivi s alelima iz genetskih profila sorata maslina zastupljenih u
bazama OleaDB i WOBGC, i to posredstvom referentnih sorata čiji genetski profil je poznat.
Razlika u duljini pojedinih alela referentnih sorata između baza i aktualnog istraživanja,
ukoliko postoji, iznosi najviše četiri nukleotida, ali su te razlike konzistentne za bilo koju
grupu referentnih sorata, odnosno dužinu pojedinih alela. Te razlike su tehničke prirode i
proizlaze iz načina očitavanja uređaja za kapilarnu elektroforezu koji npr. za svaki alel
prikazuju po dva ili čak tri grafička ''vrha'', jedan do drugoga, koji se razlikuju za jedan
nukleotid, ali je isto tako moguć pomak određenog alela za dva ili tri nukleotida, što je
uobičajeno kod laserskog očitavanja florescentnih fragmenata u kapilarnim elektroforezama,
pa zahtijeva harmonizaciju rezultata kod njihove usporedbe između različitih laboratorija
(Wang i sur., 2018.). Ovakve razlike se pojavljuju i u usporedbi između rezultata za
'Krvavicu' i dviju navedenih baza, međutim riječ je o istim, identičnim alelima. Usporedbom
genetskog profila sorte 'Krvavica' sa usporedbom drugih sorata genotipiziranih u Hrvatskoj
(podaci nisu prikazani), kao i njenom usporedbom s profilima sorata zastupljenima u bazama
SSR profila OleaDB i WOBGC ustanovljeno je da je genetski profil skradinske 'Krvavice'
jedinstven i da nema niti jednog drugog genotipa masline identičnog genetskog profila
unutar germplazme maslina koja je do sada genotipizirana.
Tablica 3. Genetski profil sorte 'Krvavice’ (UniZg) i istovjetni aleli prisutni u bazama SSR
profila maslina OleaDB i WOBGC, izražena u parovima baza (bp)
SSR početnica UniZg OleaDB WOBGC
ssrOeUA-DCA3 233/249 232/249 229/245
ssrOeUA-DCA5 205/205 206/206 203/203
ssrOeUA-DCA9 194/204 194/204 192/202
ssrOeUA-DCA14 180/190 181/191 - / -
ssrOeUA-DCA16 150/175 150/174 148/173
ssrOeUA-DCA18 179/179 177/177 174/174
UDO099-043 174/210 174/212 172/210
GAPU-71B 127/141 130/144 127/141
GAPU-101 190/200 191/201 189/199
GAPU-103A 136/159 136/159 133/157
EMO90 185/187 186/188 181/183
Zaključak
U ovom radu prikazan je morfološki opis skradinske sorte 'Krvavica' na bazi morfologije lista,
cvata, ploda i koštice. Prvi put je prikazan i genetski profil sorte 'Krvavica' pomoću dogovornih
SSR markera. Usporedbom genetskog profila 'Krvavice' s genetskim profilima sorata masline u
Hrvatskoj i sortama zastupljenim u bazama OleaDB i WOBGC zaključujemo da je 'Krvavica' s
područja skradinskog zaleđa jedinstvena sorta i da nema niti jednog genotipa istog genetskog
profila unutar germplazme maslina koja je do sada genotipizirana.
Napomena
Ova istraživanja rezultat su projekta Genetska identifikacija masline 'Krvavica' kojeg je
financirao grad Skradin